富血小板血浆在口腔颌面外科应用的研究趋势

日期：2013-08-29

富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)是自体源性、浓缩的含人血小板的血浆,是全血经过离心、分离而得到的血小板浓缩物，亦称之为血小板凝胶、富生长因子血小板或自体浓缩血小板。PRP富含由血小板分泌的七种与所有创伤愈合过程有关的蛋白生长因子。这些生长因子包括3种同分异构体的血小板衍生生长因子（PDGFαα,PDGFββ,PDGFαβ），转化生长因子-β1（TGF-β1）、转化生长因子-β2（TGF-β2），表皮样生长因子（EGF），血管内皮生长因子（VEGF），成纤维细胞生长因子（FGF），胰岛素样生长因子（IGF）等［1，2］，它也含有血液中存在的3种蛋白质:纤维素、纤粘连蛋白及亲玻粘连蛋白［3］。这些因子对促进细胞的增殖与分化及组织的形成有着极其重要的作用。

　　1  富血小板血浆的制备及原理

    目前，PRP制备方法已明显简化，在普通条件下于手术室即可以制备。但在离心过程中必须保持无菌，并且在没有血小板溶解或破坏的高浓度下分离。不同的PRP仪制备的PRP结果不同。有些PRP仪不能产生足够数量的、促进愈合的浓缩的血小板，这可以解释许多关于使用PRP无效的研究。真正的PRP应是自体的，因异体血小板没有活力，且不能分泌生物活性生长因子，其细胞膜亦是抗原，可刺激机体产生抗体。

    PRP制备方法大致分为两类。一类通过手工操作，利用离心机等简单仪器在普通血库条件下制备，易于开展，但操作步骤较为繁琐；另一种方法为使用专门的血液分离仪器自动分离制备PRP。此法简单迅速，可将分离后剩下的血液成分及时回输到患者体内。制备PRP时，需要在血液中加入抗凝剂，常用抗凝剂为10%柠檬酸钠和EDTA。使用时，在PRP中加入凝集剂10%氯化钙和凝血酶，使其形成凝胶，可起粘结作用；同时将生长因子限制在凝集块内不易流失，有利于其发挥作用，且容易成形。

    不同的离心次数、离心力和离心时间制备的PRP中所含血小板浓度和活性同制备时的离心次数、离心力和离心时间有明显因果关系，不同制备方法获得的PRP中血小板的浓度为全血中的1.9~10倍［1，8，9］。其制备原理相同：即抽取全血，利用血液中各组分的沉降系数不同经梯度离心，将血液分为3层，底层为沉降系数最大的红细胞，最上层为上清液即乏血小板血浆（platelet-poor plasma,ppp），两者交界处有一薄层（buffy coat），一般肉眼不易看出，即富血小板血浆层。然后提取上清液及交界处以下的一部分红细胞，改变离心力再次离心，即可得到含有高浓度血小板的PRP。当离心力大于250 g时，会过多破坏血小板；离心时间小于5 min时，PRP中血小板浓度与全血中血小板浓度无显著差别。为此提示：离心以200 g离心力、10 min离心时间为最佳。也可将获得的PRP进一步浓缩，得到浓缩的PRP(concentrated platelet-rich plasma,cPRP),可以使血小板浓度进一步提高至全血的16倍。

　　2  PRP可能的作用机制

    目前对于PRP促进骨再生的机制尚未完全阐明。可能的作用机制是：PRP与凝血酶、氯化钙混合形成凝胶，其中所含的血小板α颗粒释放生长因子而起作用。其中最重要的是PDGF和TGF-β。这些生长因子在凝集十分钟后开始分泌，因此，PRP必须在凝集开始后十分钟内、在抗凝状态下制备并应用。凝集时，血小板被激活，α颗粒与血小板膜融合，通过添加组蛋白及醣侧链而成为活性状态，生长因子通过跨膜受体结合到细胞膜外表面。研究表明，成人骨髓基质干细胞、成骨细胞、成纤维细胞、内皮细胞及表皮细胞表达PRP中相关的生长因子受体。这些跨膜受体反过来诱导内源性的细胞内信号蛋白的活性，引起细胞增殖、血管生成、基质形成、胶原合成等细胞的基因序列表达。PDGF为一种糖蛋白，可刺激骨髓基质细胞的有丝分裂，增加成骨细胞的数量；也可刺激内皮细胞的生长，促进受植区的毛细血管的生成；刺激单核巨噬细胞趋化。TGF-β可激活成骨前体细胞趋化及有丝分裂，刺激胶原基质沉淀，抑制破骨细胞形成及骨吸收；血管内皮生长因子（VEGF）是强有力的血管生成因子，可促进创口愈合及血管化。
    骨修复是一个长期的过程，而血小板在创口中的寿命仅有7 d，一旦颗粒耗尽，即相继死亡。在生长因子作用下的骨髓基质细胞转化为成骨细胞的活性及数量增加，成骨细胞本身也分泌TGF-β作用于邻近细胞及自身，形成良性循环。巨噬细胞也被血小板刺激后通过血管到达移植区，通过分泌巨噬细胞源性生长因子及其它因子承担调节创口愈合的功能。

　　3  PRP 在口腔颌面外科的应用

    颌骨由于其解剖及功能上的特殊性，其缺损的修复一直是口腔颌面外科临床所面临的难题之一。传统的颌骨重建方法主要有自体骨移植、异体或异种骨移植、人工合成生物材料等,存在着骨源有限、传播疾病、相容性及无诱导活性等缺陷。近期甚为活跃的组织工程化人工骨虽然有非常良好的应用前景，但是由于存在种子细胞需分离纯化、体外扩增及诱导成骨细胞方向分化等程序需时较长，而支架材料的物理、化学性能、组织相容性及降解率等与种子细胞的复合尚缺乏有效的调控，生长因子的适宜比例难以确定 ，故临床应用还有很长的路要走。因此，骨缺损的再生与重建是当前的热门研究课题之一。

    应用PRP行颌骨缺损的重建是近期提出的一个研究方向,并且已有在颌面部根治性外科切除术后、颌骨重建、牙槽嵴裂的修复、牙种植外科及其它相关的骨科领域成功应用的报道。

    在颌面部根治性外科切除术后遗留一些重要的硬组织及软组织缺损。对这些缺损的修复主要是功能性修复。优先的重建方法为：1）在手术切除时骨的稳定及软组织的重建；2）延迟进行骨的定形重建，让软组织创口愈合。在手术过程中常规应用PRP，当软组织分层缝合时，在组织下应用一厚层的血小板凝胶，利用其凝胶的性质止血及粘结组织瓣关闭创口，通过凝胶内血小板的激活及前述的生长因子产物的释放促进创口愈合。

    自体血小板凝胶复合颗粒松质骨及骨髓（PCBM）压缩在异体或异种支架内，使移植物可获得足够的、充实的填充置入。除了可粘结软组织瓣以外，凝胶内的血小板还可释放大量的生长因子促进创口的愈合。应用此项技术的所有病例均能满足Marx的下颌骨重建的成功标准。然而因受区软组织切除后常造成与口腔交通，导致移植物继发感染而失败达35%。在这种情况下将穿通处采用荷包缝合，应用一层PRP凝胶，可避免感染或移植失败。应用颗粒松质骨及骨髓复合自体纤维素凝胶（autologous fibrin adhesive,AFA）重建肿瘤根除术后遗留的下颌骨节段性缺损。术后随访，全景片结果显示骨重建在4周时显著。用PRP干预体外培养的骨髓基质细胞，发现PRP加速骨髓基质细胞的生长，基质细胞定向分化为成骨细胞后的成骨活性较单纯培养细胞高，分泌ALP及形成钙盐的能力强，细胞增殖及分裂数目显著高于对照常规培养组。应用复合PRP移植骨修复下颌骨缺损，结果复合PRP移植骨是单纯移植骨修复速度1.62~2.16倍，骨密度为（74.0±11）%高于对照组骨密度（55.1±8%），（P<0.005）。

    应用PRP复合多孔矿化牛骨诱导组织再生（PRP/BPBM/GTR）与GTR治疗人牙周骨缺损，术后3周伤口完全愈合，PRP/BPBM/GTR组袋深度为2.83~2.89 mm, GTR组牙周袋深度为4.13~4.16 mm。临床上皮附着水平PRP/BPBM/GTR组比GTR组增加为1.75~1.84 mm;龈退缩水平两组间无明显差别；PRP/BPBM/GTR 骨缺损充满平均为4.66~4.78 mm,GTR组为2.26~2.31 mm,两者间差别有统计学意义。

    口腔种植技术常面临的难题之一是局部骨量不足的问题。严重的牙槽嵴萎缩常不能行种植体植入。垂直向的下颌骨萎缩可通过牵引成骨解决，牵引成骨期间成骨前体细胞向成骨细胞的增殖及分化，此过程依赖于局部血管化及足够的血供。PRP中的PDGF可促进骨生成，术后60 d时X线检查新生骨有早期矿化的迹象；牵引器去除后可见未重建的编织骨，但可以维持种植体的稳定。上颌后牙区牙槽骨高度不足时，行种植体植入时常易造成上颌窦底黏膜穿通致种植体周围感染而失败。此时应用自体髂骨复合PRP窦底提升技术，同期行种植体植入与未复合PRP的窦底升高术相比愈合时间缩短了1/3。用Bio-Oss复合自体PRP上颌窦提升同期植入骨内牙种植体， 4周时骨密度达到或超过邻近正常骨密度，可以负载修复体，比没有复合PRP的Bio-Oss时间缩短3~4倍。

　　4  PRP的应用前景及存在的问题

    PRP中含有高浓度的生长因子，且完全是自体的，具有与体内类似的比例，满足了早期骨愈合所需的生长因子的需要；同时其自身所具有的粘合性有利于移植物的粘附、防止生长因子的流失及骨骼的愈合与修复，而且使用方便。其生长因子不进入细胞内或细胞核内，使正常的愈合过程加速，无致畸作用,也不具有诱导肿瘤形成的能力。因此，复合PRP的移植骨是一种安全的、简便的、价廉的解决颌骨缺损、牙周骨缺损、种植前骨缺损修复的外科方法。

    由于PRP用于骨再生是近几年才发展起来的，目前还存在许多尚待解决的问题。首先，目前PRP制备尚无统一的标准，未能建立制备高效稳定PRP制备方法；其次，不同方法制备PRP所含血小板数量差异很大，PRP中血小板数目与促进骨再生最佳量效关系尚不能确定；还有， PRP中不同生长因子的生物学特性、生物学作用及促进骨再生的机制目前尚未完全阐明。有学者对PRP促进骨再生的效果持怀疑态度。他们分别应用PRP复合自体骨、Bio-oss、有机骨基质等，未能得到PRP有效促进骨再生的证据。因此，目前关于PRP还有许多尚待解决的问题，在临床应用以前应实行循证医学，建立可靠的、可重复的动物模型；然后设计严格的、标准化的人群试验。