富血小板血浆在骨科领域的应用

日期：2013-08-29

　　富血小板血浆( plate let rich plasma, PRP) 是自体全血经过梯度离心、分离得到的血小板浓缩物, 血小板含量丰富。当血小板激活时, 能释放多种生长因子,它们在促进骨细胞和成骨细胞的增殖、生长、分化和组织的形成过程中起着重要的作用[1]。自1998年Marx等[2]首次用PRP复合移植骨修复下颌骨缺损以来，PRP已逐渐应用于口腔、整形、骨科、耳鼻喉科、神经外科等领域的组织修复中。本文现就PRP的分离、制备和其在骨科领域的应用以及存在问题进行综述, 并对其应用前景作一展望。皖南医学院弋矶山医院创伤骨科杨民

　　1 PRP的分离和制备

　　PRP是根据血液中各组成成分沉降系数不同，通过密度梯度离心法将PRP从全血中分离出来的PLT浓缩物，但目前尚无统一的制备方法[3]。 不同离心次数、离心力、离心时间以及PLT不同的激活方式所制备的PRP中，PLT数量、各种生长因子浓度、白细胞数量各不相同[4];且各种手术方式以及应用PRP的时间亦产生不同的生物效应，因此产生了对PRP生物效应的分歧[5]。根据不同生理病理需要，制备不同生长因子含量的PRP是未来研究的方向。

　　PRP的制备方法大体可分为手工制备和全自动制备两种。手工制备过程较繁琐，但所需设备简单，易于开展。全自动制备需要特殊设备，目前常用设备有SmartPReP 系统、Trissee 系统、Platele concentrate collection系统、Curasau 系统等。手工操作分离法与全自动血小板分离机分离法在离心后，血小板数量无明显差异，虽然全自动血小板分离机操作简便，自动化程度高，制备得到的PRP血小板纯度和浓度均高，但此方法一般用于用血量较多(一般在150ml以上)或需建立静脉循环通道，目前主要用于血库血小板的采集以进行成分输血，因其成本较高，限制了其在临床的广泛应用。但无论是何种制作方法，其制备原理均相似，即根据血液中各组分的沉降系数进行分层制备。1次离心后血液可分为3 层，最底层是沉降系数最大的红细胞，最上层是上清液，交界处有一薄层，即富血小板层。一次离心后弃去上清液或红细胞层，然后改变离心力再次离心，可分离更多血小板。两次离心法仍是目前制备PRP的常用方法。刘彩霞等[6]比较了动物模型中不同离心力和离心时间所制备的PRP对牵张成骨的影响，结果显示应用Landesberg法以两次离心(每次200 × g、离心10 min)法制作的PRP血小板计数明显高于全血，为全血的6.17 倍;血小板回收率超过86%，促进新骨生成的作用较明显。离心力> 250 × g时会导致血小板破坏过多，而一次离心时间< 5 min得到的PRP血小板浓度与全血无明显差异[7]。Marx[2]等在制作PRP时发现，先进行高速离心，1次离心后界面以下2mm的红细胞层血小板浓度最高，弃去上清液后再次以低速离心，这样可更好地提取血小板。但多数学者研究认为，采用改良Appel[8]法，即先以低速离心后吸取全部上清液、交界层下少部分红细胞置于另一支离心管，然后高速离心，所得的血小板回收率较高。

　　富血小板血浆的作用机理

　　PRP的作用是通过生长因子的相互作用和相互调节下完成的, 生长因子分泌后立即黏附至靶细胞膜表面，激活细胞膜受体。这些膜受体再诱导出内在的信号蛋白，激发细胞正常的基因序列表达。因此，PRP释放的生长因子不进入靶细胞内，不会导致靶细胞的遗传性能发生改变，仅使正常愈合过程加快。虽所有参与组织修复与重建的细胞因子作用机制仍不明确[3]，但是细胞因子对组织修复与重建的部分作用已经明确，如：PDGF是最早出现在骨折部位的生长因子之一, 可以刺激骨髓基质细胞的有丝分裂,增加成骨细胞的数量; 刺激内皮细胞的生长, 促进受植区的毛细血管的生成; 还可以刺激单核巨噬细胞的趋化。作为一种促进有丝分裂和生物趋化因子, 可以在创伤骨组织中高度表达, 促进成骨细胞的趋化、增殖, 并增加胶原蛋白合成的能力[ 9] ;TGF-β以旁分泌和/或自分泌的方式作用于成纤维细胞、骨髓干细胞、成骨前体细胞和破骨细胞, 刺激成骨前体细胞及成骨细胞的趋化、有丝分裂及胶原纤维的合成, 抑制破骨细胞的形成和骨吸收, 在骨折修复中具有极为重要的作用[ 10] ;IGF促进成骨细胞的增生和迁移作用, 提高成骨细胞活力 ; VEGF可诱导内皮细胞增殖迁移从而促进新生血管形成等[11]。另外，激活的PLT同时释放大量蛋白质，这些蛋白质对组织再生均有重要意义。凝血酶可以募集周围组织血管内皮细胞，增强其活力，人体脐静脉三维培养条件下，凝血酶可刺激成纤维细胞增殖及新生毛细血管形成，同时可诱导负反馈，从而限制新生毛细血管合成[12]。纤维蛋白刺激角化细胞迁移，实现细胞和细胞间的相互作用，对细胞形态恢复具有重要意义[13]。

　　3 PRP 在骨科领域的应用

　　3.1 骨缺损修复

　　骨缺损的修复一直是骨科临床所面临的难点之一, 目前对骨缺损修复的方法主要有自体骨移植、同种异体骨移植、生物材料填充、组织工程技术、基因治疗等。自体骨移植时虽可以取得满意的疗效,但骨来源有限, 且取骨不仅需要额外的手术操作,还增加患者痛苦, 同时还会引起多种术后并发症及附加损伤。组织工程学的创立和发展为骨缺损的修复提供了新的思路和方法。复合成骨细胞和/或生长因子的生物材料具有良好的骨诱导性，在修复骨缺损中具有良好的应用前景。但是生长因子大多于体外制备，且多为单一因子，制备复杂，价格昂贵。Assoian [ 14] 首先发现了血浆中提取的PRP中含有多种生长因子, 为骨缺损的修复提供了广泛的应用前景。Marx[ 2 ]最早应用PRP进行骨缺损修复的临床研究，其研究结果表明, PRP复合移植骨修复速度比单用移植骨修复速度快1.162倍至2.116倍, PRP组移植骨密度(74.0% ±11% )明显高于对照组(55.1% ±8% )。Fu jimori等[ 15]将自体骨复合PRP用于兔胫骨缺损, 研究发现PRP不仅加快新骨形成, 同时提高新生骨质量。Kovacs等[16] 在犬下颌骨缺损修复研究中发现通过骨密度评价和组织学评价, 复合PRP的生物材料组均优于单纯使用生物材料组, 认为PRP对骨缺损有修复作用。

　　3.2 脊柱融合方面的应用

　　PRP的研究为脊柱融合开辟了一条新途径, 它解决了自体骨来源有限, 异体骨免疫排斥反应, 生物材料无骨诱导活性, 单一生长因子制作复杂、价格昂贵等缺陷, 明显促进成骨作用, 加速骨愈合能力, 提高脊柱融合率, 促进患者术后病情恢复及生活质量的提高。但目前PRP在脊柱融合方面尚处于研究阶段, 相关报道有限。Lowery等[ 17]证实PRP能够早期促进骨融合, 在临床上应用于腰椎融合时产生良好的效果。Hee 等[18] 报道，自体髂骨复合生长因子早期骨融合率高于单纯自体髂骨植骨，23例应用自体髂骨复合PRP 患者中，术后4 个月及6 个月X 线评价融合率为70% 及96%，而自体髂骨移植患者中分别为36% 及94%，术后24 个月，两组间无明显差异，分别为96% 和94%。Castro 等[19]在腰椎间孔入路腰椎椎间植骨融合术研究中发现，复合PRP组融合率低于对照组19%，分析原因可能与腰椎生物力学环境、制备PRP的技术、PLT数量、功能以及生长因子浓度有关。

　　3.3 半月板关节软骨损伤与修复

　　通常，受损的关节软骨本身只有很弱的再生修复能力[20]，如何对受损的关节软骨进行修复、恢复关节面完整性、重建关节功能和防止关节退变是再生医学的研究热点。动物实验及临床应用均表明PRP 具有促进损伤软骨组织修复的功能。Cugat 等[21]在兔全层软骨损伤模型中，首次应用局部注射自体PRP，发现软骨的生物力学行为明显改善，软骨细胞增殖，软骨损伤明显修复。Kon等[22]最近报道关节内注射PRP治疗100例患有慢性膝关节软骨退行性疾病患者(每次注射PRP 5 ml，21天注射3次为一疗程)，注射后注射口无菌包扎并嘱患者屈伸膝关节数次，术前和术后应用患者自评总体健康状况视觉类比量表(EQ-VAS)和国际膝关节评分委员会(IKDC )主观和客观评估表进行临床评分，结果显示治疗2个月、6个月和12个月后临床各项评分均较术前显著提高。Everts 等[23] 在单侧全膝关节置换手术后应用PRP，随访5个月，发现应用PRP后关节纤维化程度较对照组明显减轻，关节活动范围明显好。Mitsuyama 等[24] 研究了PRP对人类软骨细胞的作用，10 位参与试验的志愿者分别提供全血和膝关节软骨组织，用于制作PRP和提取软骨细胞，将提取出的软骨细胞分别以不同浓度的PRP处理，观测其增殖情况。10 天后观测结果显示，30% 的PRP能显著促进人软骨细胞的增殖，细胞增殖不仅受PRP影响，而且与PRP浓度的增加成正相关。如上所述，PRP可以作为修复软骨时的一种治疗选择

　　3.4 修复韧带/ 肌腱损伤

　　肌腱组织由腱细胞、纤维胶原蛋白和水分构成，自身缺乏血液供应，故受损后的愈合速度慢于其他结缔组织。随着研究深入，学者们发现生长因子在韧带修复过程中起到至关重要的作用，进而尝试利用PRP来促进或辅助治疗肌腱损伤。Anitua 等[25]将PRP与人肌腱细胞共培养后发现，随着肌腱细胞的增殖，培养基中VEGF及肝细胞生长因子(HGF)也相应增加，而VEGF具有促进血管形成的作用，HGF具有抗纤维化作用，减少瘢痕形成。临床应用PRP治疗韧带/ 肌腱损伤取得满意疗效。Sánchez等[26]收治12例跟腱撕裂患者，其中6 例作为试验组在手术同时进行PRP 辅助治疗，6 例作为对照组只进行手术治疗。结果显示试验组患者恢复活动范围较对照组早，且未发生相关并发症，Mishra等[27]应用超声引导使用PRP治疗慢性肘部肌腱疾病取得满意疗效。140例患者均首先给予理疗及其他非手术治疗，20例患者疼痛无好转，其中15 例经皮下注射PRP，对照组5 例注射布比卡因，随访皮下注射PRP 患者中，8 周后60% 患者疼痛缓解，6 个月后81% 患者疼痛缓解，25.6 个月后93% 疼痛缓解并且能在更短时间内恢复训练活动

　　3.5 预防骨与关节感染

　　骨与关节感染是骨科手术面临的难题之一，常用预防方法是在围手术期应用抗生素[28]。但长期大量应用抗生素不仅带来各种系统副作用，还会导致耐药菌株的出现[29]。因此，有必要探索一种新的解决骨感染问题的方法。PRP由于其含有的高浓度血小板可以释放大量生长因子，当PRP被凝血酶激活后形成血小板-白细胞凝胶(PLG)，其中含有高浓度的血小板和白细胞，这些细胞成分在机体先天免疫防御反应中发挥着趋化、吞噬和氧化杀菌等重要作用[30] 。此外，血小板还可释放大量生长因子促进被炎症破坏的组织细胞再生，为炎症消退提供良好的局部微环境。PRP的这种多重特性使其具有传统抗生素所不具备的优势。因此，作为一种“生物抗菌制剂”，PRP为我们预防和治疗骨感染提供了一种新的思路。Bielecki 等[31] 通过纸片扩散法研究发现，PLG在体外可以抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长。Moojen 等[32] 也报道了PLG在体外具有抑制金黄色葡萄球菌生长的作用。此外，一些临床研究表明PLG可降低外科手术后的出血和感染发生率[33-34]。PLG在体外不仅可以抑制金黄色葡萄球菌的生长，而且在体内局部应用还可以抑制细菌生长，还可以协同机体免疫防御系统杀灭细菌，从而预防骨与关节感染的发生。

　　4 展望

　　采用生物的方法解决生物和医学问题是目前研究组织修复的热点。PRP完全是自体的, 无疾病传染及免疫排斥反应, 从根本上解决了传播疾病的危险及骨组织工程学一直面临的移植物难以存活的难题; PRP中含有多种高浓度的生长因子, 各生长因子的比例与体内正常比例相似, 并具有最佳的协同作用, 既有单一因子的生物学效应, 又有各种生长因子之间的相互作用。这在一定程度上弥补了单一生长因子刺激成骨效果不佳的缺点, 满足了早期骨愈合所需生长因子的需要; PRP有促凝血的作用, 可刺激软组织再生, 促进伤口早期愈合; PRP中所含的生长因子不进入细胞内或细胞核内,使正常的愈合过程加速, 无致畸作用, 也不具有诱导肿瘤形成的能力; PRP制作简单且对患者的损伤小, 只需从患者的静脉取血即可制作PRP, 国外已有专门制作PRP的仪器, 操作简便并且所需时间短。因此, PRP是一种安全的、简便的、廉价的可用于骨科的各个治疗领域，应用前景广泛。

　　但PRP用于临床尤其是在骨科领域仍有许多尚未解决的问题，如PRP制备无统一标准，不同方法制备的PRP生长因子浓度差异大，PRP所含生长因子数量及其生长因子的相互作用机制仍不明确等。因此对PRP研究首先要建立一套高效稳定、对PLT破坏小、纯度高而稳定的PRP制备方法; 其次在应用PRP时尽量避免影响PRP疗效的因素; 选择适当的载体使PRP 与载体结合以提高PRP骨再生能力, 建立动物模型, 设计标准化的试验, 为PRP的临床应用提供依据。